Elektroforéza

Pomůcky:

Kádinka (50 ml, 100 ml), odměrný válec, elmag. míchačka, míchadlo, automatické pipety, násady na pipety, plastové mikrozkumavky, špachtle, misky, střička, třepačka, elektroforetický přístroj, Elektrodový pufr (0,025 mol.dm^-3 Tris, 0,192 mol.dm^-3 glycin, pH 8,3), pufr do gelu (2,25 mol.dm^-3 Tris, 0,1655 mol.dm^-3 HCl), 30 % (w/v) akrylamid, 2 % (w/v) bisakrylamid, 10 % (w/v) persíran amonný, vzorkovací pufr (0,125 mol.dm^-3 pufr do gelu, 0,01 % (w/v) bromfenolová modř), TEMED, fixační roztok (10 % kys. trichloroctová), barvící roztok (0,1 % (w/v) CBB R-250 v 15 % (v/v) kys. octové a 45 % (v/v) methanolu), odbarvovací roztok (40 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) kys. octová), vaječný bílek

Postup:

Akrylamid a BIS jsou neurotoxické látky. S jejich roztokem pracujeme vždy s co největší opatrností, v gumových rukavicích. Nikdy tyto látky nepipetujeme ústy!

Příprava 8 % gelu

Destilovaná voda	5,41 ml
Pufr do gelu	2,4 ml
Akrylamid	4 ml
BIS	3 ml
TEMED	50 ul (mikro litrů)

Kádinku umístíme na elektromagnetickou míchačku nastavenou na hodnotu 250 - 300 otáček za minutu a zapneme ji. Podle tabulky odpipetuje příslušná množství daných látek do kádinky.

Formu na gel uzavřeme vložením dvou plíšků. Formu dáme do plastového kelímku, aby případný uniklý gel neznečistil pracovní plochu. Poté zahájíme polymeraci gelu přídavkem 140 m l čerstvě připraveného 10 % roztoku persíranu amonného (ten si připravíme do mikrozklumavky s uzávěrem – 1 ml) do kádinky postavené na míchačce.

Po promíchání (cca 8 sekund) nalijeme roztok do formy tak, aby nevznikaly bublinky.

Po nalití ihned zasuneme do roztoku gelu hřebínek. Do kádinky se zbytky roztoku gelu nalijeme vodu. Gel necháme polymerizovat a připravíme si vzorky. Z roztoku vaječného bílku odpipetujeme postupně 0,1; 0,2; 0,3 a 0,4 ml do plastových mikrozkumavek a doplníme je přídavkem 0,4 ml vzorkovacího pufru.

Z formy s gelem odstraníme plíšky (špachtlí odřízneme gel od plíšků, pak je vyjmeme) a vysuneme hřebínek.

Vodu na gelu slijeme a případnou vodu v jamkách pro vzorky opatrně odsajeme injekční stříkačkou.

Poté do jednotlivých jamek (krajní jamky nevyužíváme, dochází zde k deformaci zón) odpipetujeme vzorky bílkovin.

nanášení vzorku

Elektroforetickou vanu naplníme 180 ml elektrodového pufru. V pufru nesmí být přítomny bubliny. Formu s gelem vložíme do elektroforetické vany a to pomalu a velmi opatrně, aby nedošlo k vyplavení vzorků z jamek! Do elektrodového pufru nejprve ponoříme pravou stranu gelu, pak pomalu stranu levou (se vzorky). Při elektroforéze budou vzorky putovat z levé strany na pravou (ke kladné elektrodě), proto musí být vzorky byly na levé straně (obr. 4)!

pokládání gelu

Vanu přikryjeme víkem (kabely vedoucí na víko elektroforetické vany musí být na vzdálenější straně)

zapneme zdroj napětí, který nastavíme na hodnotu 150 V.

Po doputování zóny bromfenolové modři asi 1 cm před konec gelu (cca 80 min.) Elektroforézu ukončíme. Formu s gelem vyjmeme a gel necháme opatrně sklouznout do misky. Gel několikrát propláchneme destilovanou vodou. Pro orientaci rozdělených zón na gelu odřízneme pravý dolní roh gelu. Gel pak vložíme do misky s fixačním roztokem a misku dáme na třepačku. Po 5 minutách gel vyjmeme, fixační roztok vrátíme zpět do zásobní láhve. Gel opět propláchneme a vložíme jej do misky s barvícím roztokem. Gel necháme 15 minut barvit na třepačce. Po obarvení slijeme barvící roztok zpět do zásobní láhve, gel několikrát propláchneme destilovanou vodou a vložíme jej do misky s cca 20 ml odbarvovacího roztoku. Gel odbarvujeme jednou, popřípadě dvakrát po dobu alespoň 15 minut.